周芳丽，李 军，张丽艳，赵泽林
(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)
南板蓝根为爵床科马蓝(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)的干燥根及根茎，性寒味苦，归心、胃经，具有清热解毒、凉血消斑的功效，临床用于温疫时毒，发热咽痛，温毒发斑、丹毒[1]。广泛分布于我国的华西、西南，尤其是广西、福建，南方地区多以此入药[2]。南板蓝根为多年生草本，产量低，野生资源分散较少[3]。现代药理学研究表明，南板蓝根具有广泛的药理作用，主要包括抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、保护肝脏等作用[4-9]。含有生物碱、氨基酸、多糖、苷类等多种有效成分[10-13]。其中多糖是研究较多的一类成分之一，具有多种生物学活性，可作为指标性成分对南板蓝根样品进行鉴别，其含量也可作为南板蓝根的质量评价标准。研究表明多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫调节、调节肠道菌群等多种药理活性[14-16]，具有很好的开发前景。本实验主要围绕多糖提取工艺以及含量测定两方面进行研究，以期为南板蓝根多糖的工艺开发提供参考。
1.1 仪器
UV2501PC紫外分光光度仪(日本岛津公司)；
HH-6数显恒温水浴锅(金坛市三和仪器有限公司)；
ST-16R高速冷冻离心机(赛默飞公司)；
EPED-E2-20TF型超纯水器(南京易普易达科技发展有限公司)；
XS205型十万分之一电子天平(瑞士梅特公司)。
1.2 试药
无水乙醇(分析纯，批号：20211101)；
苯酚(分析纯，批号：20190801)；
浓硫酸(分析纯，批号：20210701)；
纯水；
葡萄糖对照品(批号：20200110，天津市科密欧化学试剂有限公司)。本实验采用的南板蓝根样品经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为爵床科马蓝(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek)的干燥根及根茎，采集后放于干燥阴凉处备用，见表1。
表1 15批南板蓝根样品来源Tab.1 Sources of 15 batches of Baphicacanthus cusia samples
续表1
2.1 对照品溶液的制备
精密称定干燥至恒重的葡萄糖对照品20.39 mg，置于100 mL的容量瓶中，然后配制成每1 mL含0.2039 mg对照品溶液，即得。
2.2 供试品溶液的制备
精密称定南板蓝根样品粉末(三号筛)1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30 mL水，加热回流50 min，抽滤定容至50 mL的容量瓶，混匀。精密量取2 mL的抽滤液，加无水乙醇至浓度为80%，摇匀，冷藏20 h后，置于离心机中，4000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，最后沉淀用热水溶解并定容至10 mL，即得供试品溶液。
2.3 显色测定方法
精密吸取2 mL的供试品溶液于试管中，分别加入2 mL 5%的苯酚，摇匀，加入5 mL 浓硫酸，摇匀，静置10 min，于水浴中保温15 min，冷却至室温。另取2 mL蒸馏水以同样的方法配制空白对照组。
2.4 检测波长的考察
分别量取对照品溶液和供试品溶液，按照2.3项下方法进行显色，于紫外分光光度计下200～800 nm波长进行扫描。结果显示：南板蓝根供试品与葡萄糖对照品在490 nm处均有最大吸收。因此以490 nm作为检测波长。
2.5 方法学考察
2.5.1 线性关系考察
精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、10.0 mL、20.0 mL，分别置20 mL的容量瓶中，加水定容。按照2.3项下方法进行显色，于490 nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为Y=3.02874X+0.05769(r2=0.9991)。葡萄糖标准溶液在10.20～203.9 μg/mL线性关系良好。
2.5.2 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液2 mL，按2.3项下方法进行显色，连续测6次吸光度，RSD为0.26%，表明仪器的精密度良好。
2.5.3 重复性试验
精密称定南板蓝根6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，2.3项下方法进行显色，测定吸光度，RSD为2.52%，表明该方法重复性良好。
2.5.4 稳定性试验
取同一批南板蓝根供试品溶液，按照2.3项下方法进行显色，分别在0 h，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h进样吸光度测定，其RSD为0.80%，表明该供试品溶液在5 h内稳定性良好。
2.5.5 加样回收率试验
取已知含量的同一批次南板蓝根6份，精密称定，分别精密加入与样品中含量相当的对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，根据2.3项下方法进行显色，测定吸光度，见表2。平均回收率为101.25%，RSD为2.43%，表明样品加样回收率较好。
表2 多糖加样回收测定Tab.2 Determination results of polysaccharides and spiked recovery
2.6 样品测定
分别精密称定15批南板蓝根样品粉末(3号筛)各1.0 g，按照2.2项下方法制备供试品溶液，根据2.3项下方法显色，于490 nm波长处测定吸光度，见表3。
表3 15批南板蓝根样品中多糖的质量分数(mg/g)Tab.3 Mass fraction of polysaccharides in 15 batches of Baphicacanthus cusia samples
3.1 提取方法
精密称定南板蓝根样品2份，每份1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30倍水，分别加热回流和超声提取30 min，抽滤定容至50 mL的容量瓶，混匀。精密量取2 mL，加无水乙醇至浓度为80%，按照供试品制备方法及显色方法进行处理，于490 nm波长处测定吸光度，结果回流提取法中多糖的含量为43.82 mg/g，超声提取中为34.18 mg/g。故以加热回流法作为提取方法。
3.2 料液比
精密称定南板蓝根样品4份，每份1.0 g，置具塞锥形瓶中，分别精密加入20、30、40、50倍水，加热回流30 min，抽滤定容至50 mL的容量瓶，混匀。精密量取2 mL，加无水乙醇至浓度为80%，按照供试品制备方法及显色方法进行处理，得到多糖的测定结果分别为27.01 mg/g、33.04 mg/g、30.90 mg/g、27.17 mg/g。故选择30倍水。
3.3 提取时间
精密称定南板蓝根样品5份，每份1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30倍水，分别加热回流提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，抽滤定容至50 mL的容量瓶，混匀。精密量取2 mL，加无水乙醇至浓度为80%，按照供试品制备方法及显色方法进行处理，得到多糖的测定结果分别为36.72 mg/g、37.86 mg/g、38.57 mg/g、45.13 mg/g、38.77 mg/g。故以50 min作为提取时间。
3.4 醇浓度的优化
精密称定南板蓝根样品1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30倍水，加热回流50 min，抽滤定容至50 mL的容量瓶，混匀。精密量取4份提取液，每份2 mL，分别加无水乙醇至浓度为75%、80%、85%、90%，按照供试品制备方法及显色方法进行处理，得到多糖的测定结果分别为33.67 mg/g、41.90 mg/g、51.80 mg/g、40.78 mg/g。故选择85%作为乙醇优化浓度。
3.5 工艺验证
根据以上的提取工艺考察，最终确定的提取工艺为南板蓝根样品加30倍水，加热回流提取50 min，以85%的乙醇进行多糖的沉淀。
精密称定南板蓝根样品1.0 g，置具塞锥形瓶中，按确定的工艺条件进行提取，结果多糖的平均含量为45.63 mg/g，RSD为1.67%(n=3)。
多糖具有多种生物学活性，是中药研究中的重点关注对象。本实验通过水提醇沉法，可除去其中的可溶性糖以及相关杂质的影响，运用苯酚-硫酸法结合UV技术，测定15批南板蓝根样品中多糖的含量，结果不同产地与不同批次之间的多糖含量差异较大，这可能与样品的生长环境、栽培技术以及采收时间有关。多糖测定方法应用最为广泛的有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法，这两种方法虽干扰因素多、重现性较差，但操作简单，易于快速测定[17]。苯酚-硫酸法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，而蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，其测得值实际上是全部可溶性碳水化合物的总量，因此也可以说明苯酚-硫酸法的测定结果更为合理准确，是多糖较为理想的含量测定方法[18]。
通过对提取方法、料液比、提取时间以及纯优化的考察，最终确定的提取工艺条件为30倍水加热回流提取50 min，以85%的乙醇沉淀多糖最佳。该方法操作简单，提取效率较高，以期为南板蓝根中多糖的提取工艺提供参考，致力于南板蓝根的进一步研究。
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